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    Western Blot

     Western blot检测方法1)              制胶:灌制10%分离胶和5%浓缩胶。待浓缩胶凝固后,小心地拔出梳子,移入电泳槽,加电泳缓冲液。2)        

    1. 详细信息

     Western blot检测方法

    1)              制胶:灌制10%分离胶和5%浓缩胶。待浓缩胶凝固后,小心地拔出梳子,移入电泳槽,加电泳缓冲液。

    2)              上样:各组样品加上样缓冲液并经99℃变性5 min,短暂离心后上样。样品上样量约50 μg,预染蛋白Marker上样量为5 μl

    3)              电泳:将电泳槽与电源连接,起始电压80 V,待染料前缘进入分离胶后调电压至120 V。继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。

    4)              电转:电泳结束后,准备转膜。剪6张滤纸和1PVDF膜,其大小、形状与凝胶一致。PVDF膜先在甲醇中浸泡激活约20 sec,然后与滤纸一起放入电转液中平衡10 min。打开凝胶夹,以黑色板为阴极,从黑色板向上依次放入海绵、3张滤纸、凝胶、PVDF膜、3张滤纸、海绵。除去气泡夹紧凝胶夹,放入转移槽中,黑色板对准阴极,安装好转移装置,加入电转液,200 mA恒定电流,转移1-2 h

    5)              封闭:电转结束后,把PVDF膜取出,浸泡在5%脱脂奶粉中,室温封闭1 h

    6)              一抗孵育:用1%BSA按最佳比例稀释一抗,4℃孵育过夜。抗体稀释度分别为KCa1.1 (1:500) Homer 1a (1:500)Homer 1b/c (1:2000)β-Actin (1:10000)

    7)              洗涤TBS-T洗涤3次,每次10 min

    8)             二抗孵育:用1%BSA稀释HRP标记的二抗(山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG稀释度均为1:10000,驴抗羊IgG稀释度为1:5000),与PVDF膜在室温下孵育约1 h

    9)              洗涤TBS-T洗涤3次,每次10 min

    10)          ECL法显色(暗室操作)

    l      配制ECL工作液:取等体积的A液和B液混合,放置使之升到室温。

    l      PVDF膜与工作液充分接触,室温孵育3 min

    l      曝光:暗盒中铺一张保鲜膜,将PVDF膜去尽残液,贴在保鲜膜上,然后再覆盖一层保鲜膜。黑暗中放入X光胶片,压在包好的膜上。关上暗盒,开始计时,根据信号强弱适当调整曝光时间,一般为15 min

    l      显影,定影:曝光完成后,打开暗盒,取出X光胶片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。将X光胶片在水中冲洗一下,去掉显影液,然后浸入定影液中,定影时间一般为5~10 min,用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。

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